MitoROS Tracker Red检测线粒体超氧化物检测试剂盒，LK-1350

产品简介  

线粒体超氧化物检测试剂盒 (MitoROS Tracker Red) 是一种基于 MitoROS Tracker Red（MSR） 荧光探针的高灵敏度检测工具，用于特异性检测活细胞线粒体内的超氧化物阴离子（O₂·⁻）。该试剂盒适用于多种检测平台，包括 荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪和流式细胞仪，广泛应用于氧化应激、细胞凋亡、炎症及线粒体功能相关研究。  

超氧化物的生物学意义  

超氧化物阴离子（O₂·⁻）是线粒体电子传递链（ETC）中由 NADPH氧化酶 等酶催化产生的活性氧自由基（ROS）。它既是免疫防御（如白细胞杀菌）的关键分子，也是氧化损伤的重要介质，与 神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和衰老 等病理过程密切相关[1-3]。  

检测原理 ：MitoROS Tracker Red（MSR） 是一种 线粒体靶向的二氢乙锭（HE）衍生物，具有以下特性：  

- 特异性靶向：借助 三苯基膦阳离子（TPP⁺） 结构，选择性富集于线粒体基质。  

- 高选择性氧化：仅被 O₂·⁻ 氧化（不被其他ROS/RNS氧化），生成乙锭类产物并与线粒体核酸结合，发出 红色荧光（激发峰：396nm/510nm；发射峰：580nm）。  

- 精准检测：396nm激发光 可避免其他ROS干扰，确保检测特异性[4-6]。  

1. MitoROS Tracker Red（5mM储存液）  

   - 推荐工作浓度：1-5μM（优先5μM），需根据细胞类型优化。  

   - 注意：浓度 >5μM 可能导致线粒体毒性（形态异常、探针泄漏至胞核）。  

2. 阳性对照（mSoxUp）  

   - 用于诱导线粒体O₂·⁻生成，推荐终浓度 1X（1:1000稀释），处理4小时验证探针有效性。  

应用优势  

快速灵敏：10-60分钟孵育即可检测。  

高特异性：396nm激发避免交叉反应。  

多平台兼容：适配显微成像、流式分析及酶标仪检测。  

一、试剂配制

1.染色工作液配制  

   -比例：1ul MitoROS Tracker Red (5mM) + 1ml PBS（终浓度5μM，推荐初始浓度）。  

   -调整浓度：若背景高，稀释至1-2.5μM（1:2000-1:5000）；若信号弱，提高至50μM。  

   -注意：避光、现配现用，不可长期保存。

二、实验分组设置

-阳性对照：加入1ul mSoxUp (1000X) 至1ml培养基，处理4小时后再染色（验证探针有效性）。  

-阴性对照：未处理细胞（基础荧光参考）。  

-实验组：按实验设计处理细胞。

三、染色步骤

A. 悬浮细胞

1.染色：离心收集细胞（10-100万），用0.5ml工作液重悬（密度100-1000万/ml）。  

2.孵育：37℃避光孵育10-60分钟（建议起始30分钟，根据信号调整时间）。  

3.洗涤：离心弃上清，PBS洗2次，最终用PBS重悬检测。  

B. 贴壁细胞

1.染色：吸除培养基，PBS洗1次，加入1ml工作液（6孔板）。  

2.孵育：同悬浮细胞条件。  

3.洗涤：吸除工作液，PBS洗2次，加2ml PBS观察。  

4.流式检测：需消化细胞后按悬浮细胞步骤操作。  

四、检测参数

-激发/发射波长：  

  - 精准检测：396nm/610nm（共聚焦、流式Violet610通道）。  

  - 普通荧光显微镜：510nm/580nm（可能检测其他ROS）。  

-仪器：荧光显微镜、共聚焦、流式细胞仪或酶标仪（推荐黑色96孔板）。  

五、注意事项

1.浓度优化：不同细胞需预实验确定最佳浓度（2-50μM）和孵育时间（10-60分钟）。  

2.阳性对照验证：若mSoxUp处理后信号未增强，需调整浓度或时间。  

3.避光操作：全程避光，防止探针降解。  

4.数据对比：实验组与阴性/阳性对照同步检测，确保结果可靠性。  

六、常见问题

-信号弱：延长孵育至60分钟或提高探针浓度。  

-背景高：缩短孵育至10-15分钟或降低探针浓度。  

-mSoxUp无效：某些细胞需优化处理条件或更换诱导剂。