NAD+/NADH检测试剂盒(高敏法）,LK-1529

产品介绍

通过酸性和碱性优化后的提取液分别提取样品中NAD+和NADH，NADH可通过PMS的递氢作用，还原WST-8生成甲瓒，产物在450 nm处具有特征吸收峰；NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用WST-8还原法生成甲瓒，通过吸光值变化即可定量检测辅酶ⅠNAD (H) 的含量。

一、样品准备

1. 细胞样品

贴壁细胞：吸弃培养基，每1×10⁶细胞加入200ul提取液，吹打裂解（室温或冰上）。

悬浮细胞：离心后弃上清，同比例加入预冷提取液吹打裂解。

离心：12,000×g，4℃ 5-10分钟，取上清备用。  

注：建议超滤（10kDa）去除干扰酶，提高准确性。

2. 组织样品

称取10-30mg组织，剪碎后按10mg:200ul比例加提取液匀浆。

离心同上，取上清备用。

二、试剂盒准备

1. NADH标准品配制

溶解5mg NADH于655ul配制液，得10mM母液（分装避光-80℃保存）。

标准曲线：用提取液稀释至0-10μM梯度（如0、0.25、0.5…10μM），每孔20ul加入96孔板（对应0-200pmol/孔）。

2. 乙醇脱氢酶工作液

现用现配：2ul酶+88ul反应缓冲液（45倍稀释），每孔需90ul。

三、检测步骤

A. NAD+和NADH总量测定

1. 稀释样品（细胞2-10倍，组织5-50倍），每孔加20ul。

2. 加90ul乙醇脱氢酶工作液，37℃避光孵育10分钟（转化NAD+→NADH）。

B. 单独NADH测定

1. 取50-100ul样品，60℃加热30分钟（降解NAD+）。

2. 离心后取上清20ul检测（同上步骤）。

C. 显色与读数

每孔加10ul显色液，37℃避光孵育10-30分钟（显橙黄色）。

测450nm吸光度（显色浅可延长至60分钟）。

四、数据分析

1. 标准曲线：各标准孔吸光度减去空白，绘制浓度-吸光度曲线。

2. 浓度计算：

   NADtotal：未加热样品结果。

   NADH：加热后样品结果。

   NAD+ = [NADtotal] [NADH]。

3. 比值：NAD+/NADH = ([NADtotal] [NADH]) / [NADH]。

4. 单位标准化：建议用BCA法测蛋白浓度，以pmol/mg蛋白表示。

五、关键注意事项

1. 稳定性：NADH易降解，标准品现配现用，避免反复冻融。

2. 稀释优化：初次检测建议多梯度稀释，确保结果在线性范围内。

3. 气泡控制：加酶工作液时避免气泡，影响读数。

4. 超滤建议：若结果异常，超滤去除小分子干扰物。

六、示例数据参考

细胞：NAD+含量通常高于NADH（比值约5-10:1）。

组织：小鼠肝脏NAD+约300-500 pmol/mg蛋白，NADH约50-100 pmol/mg蛋白。

按此流程操作可准确检测NAD+/NADH水平，适用于代谢研究、衰老或药物筛选实验。