siRNA 产品使用说明

常规化学合成 siRNA  为 21～23nt   的双链小分子 RNA ，产品为冻干粉形式的即用型试剂。

运输保存：

产品以冻干粉的形式常温运输。收到产品后，请于-20℃~-80℃保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心，用 RNase-freeH2O 或灭菌 ddH2O 配制成 20 μM 储存液，分装保存，避免反复冻融（建议不超过 5 次）。

表 1   20 μM 储存液的配置方法

注：1OD duplex=2.5 nmols=40  μg

使用知：

1) siRNA 呈很轻的干膜状附在管壁上，打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量 RNase-freeH2O 或 灭菌 ddH2O 后盖上管盖，震荡溶解。

2)为避免外界因素(包括酶，极端 pH 或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循 RNA 操作规则。实验过 程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。

细胞实验方法：

为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验的可靠性和可重复性,我们建议：

1)  转染实验中每个转染样品至少设置 3 个复孔；

2)  接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，尽量使细胞在各孔的表面平均分布。

1.  转染浓度：

1)   为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染 siRNA 的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞 系，推荐尝试使用几个 LipofectamineTM  2000  的浓度，并在 20-100nM 范围内改变 siRNA  的浓度， 以确定达到 最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的 siRNA 可能具有细胞系依赖性。

2)   在 30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因沉默分析至少要在转染后 24-72 h 进行。低密度转染细胞可以使 转染和分析之间的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性， 高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。

3)   不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。

4)   为了获得更好的结果，可以使用 Invitrogen 的 Opti-MEM 低血清培养基在形成复合物前稀释LipofectamineTM  2000 和 siRNA。可以使用荧光标记的 siRNA 帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，可以在每一次实验都包括荧光标记 siRNA ，作为转染效率的指示剂。

2.转染步骤：

以 LipofectamineTM  2000  转染 siRNA 于 24  孔板，转染浓度为 50nM 为例，其他规格容器转染请参考 2。

1) 接种细胞

贴壁细胞：转染前 24h，在 400 µL 无抗培养基中接种 0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为 30 - 50% 。 (注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)

悬浮细胞：转染前 24 h，在 400 µL 无抗培养基中接种 0.5-2×105个细胞，转染时细胞数量应在 4- 8×105/孔。

2)   转染步骤

A.  用 50 µL Opti-MEM    稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 50 nM)，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀。

B.  轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM 稀释 1.0  µL LipofectamineTM  2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温 下静置 5 min。

C.  混合转染试剂和 siRNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 20 min。

D.  转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

E.  细胞板置于 37℃、5% CO2培养箱中培养 18 - 48 h，转染 4 - 6 h 后可换新鲜培养基表。

表 2  转染 siRNA 产品用量参考

V1：完全或不完全培养基；V2:Opti-MEM®I(无血清、抗生素，转染专用)

注：表中数据仅供参考，对于部分细胞类型的转染试剂用量可进一步优化。

3.效果检测

转染完成后 24~72    小时均可进行 siRNA    沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、检测目的相关。

1)   RNA 水平的检测：mRNA 是检测 siRNA 沉默效率的最佳指标，siRNA 转染后 24~72 h  即可检测到靶基因 mRNA 表达明显降低，检测方法宜采用 qPCR 检测方法。注：引物设计质量很重要，需要确保检测引物有效性。

2) 蛋白水平的检测：蛋白是 RNAi  沉默效率的重要指标，其检测手段主要为 Western  Blot  等。检测时间受细胞内蛋 白质表达量、半衰期等因素的影响，一般为 48~96 h。

3) 功能筛选：应用 EdU    细胞增殖、EdUTP    细胞凋亡等方法进行细胞功能筛选。

动物实验：

提供动物实验用的各种修饰 siRNA    产品。

修饰方式：由于动物实验对 siRNA 稳定性的要求较高，尽管未修饰的 siRNA  也可以进行动物实验，但是以 Chol， OMe，PS 修饰的 siRNA 效果较好。

给药方式：局部给药：最直接的导入方式，siRNA  的导入效率较高，用量少，siRNA  能很快被吸收。适用于浅表器官和 组织，包括眼、肌肉、皮下组织等。

系统给药：一些无法通过局部给药方式到达的靶位，如内脏，器官以及一些散列分布的靶位（如淋巴细胞，转移性肿瘤 细 胞等），可使用系统性注射方式，具有广泛的组织分布，包括心、肝、脾、肺、肾等。