Annexin V-Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒 ，LK-1502

产品介绍  

本试剂盒是一种用于检测哺乳动物细胞凋亡（Apoptosis）的荧光检测工具。其原理基于凋亡早期发生在细胞膜外表面的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧这一重要现象。

Annexin V-Alexa Fluor 488 是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。它能特异性地与凋亡细胞外翻的PS结合，从而标记早期凋亡细胞。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI） 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜。对于晚期凋亡或坏死细胞，其细胞膜完整性丧失，PI可穿透细胞膜并使细胞核染红。

通过Annexin V与PI的联合使用，可以有效地区分处于不同细胞状态（活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡/坏死细胞）的细胞群体。

产品特点  

1.  高灵敏度与特异性： 可精准检测早期凋亡细胞，区分凋亡与坏死。

2.  快速便捷： 操作流程简单，仅需约20-30分钟孵育时间即可上机检测。

3.  兼容性强： 适用于流式细胞仪（Flow Cytometry）或荧光显微镜进行检测和分析。

4.  荧光信号明亮： Alexa Fluor 488染料光稳定性好，荧光强度高；PI红色荧光与绿色荧光易于区分。

5.  即用型工作液： 提供预配制的结合缓冲液（10X）和PI储存液，简化实验步骤。  

使用方法（仅供参考）  

实验前准备：

   冰盒： 整个操作过程需在冰上避光进行。

   预冷PBS： 磷酸盐缓冲液（无Ca²⁺、Mg²⁺）。

   结合缓冲液（1X）： 用去离子水将10X结合缓冲液稀释10倍，置于冰上预冷。

   细胞培养设备、离心机、流式细胞仪/荧光显微镜。

操作步骤：

1.  细胞收集与洗涤：

       收集细胞（贴壁细胞需用不含EDTA的胰酶消化，并注意轻柔吹打，避免机械损伤），用预冷的PBS洗涤细胞两次。

       离心（1000 rpm, 5 min）后，尽可能彻底地弃去上清。

2.  细胞重悬：

       用预冷的1X结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度至 1 × 10⁶ cells/mL。

3.  孵育染色：

       取100 μL细胞悬液（约1 × 10⁵个细胞）至流式管中。

       向管中加入 5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488 和 5 μL PI 储存液。

       轻轻涡旋混匀。

       在 室温（20-25°C）下避光孵育15-20分钟。

4.  上机检测：

       孵育结束后，立即向每管中加入400 μL预冷的1X结合缓冲液，混匀后置于冰上。

       在1小时内 使用流式细胞仪进行检测。

       激发波长/发射波长：

           Annexin V-Alexa Fluor 488: Ex/Em = 488 nm / 530 nm (FITC通道)

           PI: Ex/Em = 488 nm / 617 nm (PE或PI通道)

结果分析（流式细胞术）：

   左下象限 (Annexin V-/PI-)： 活细胞。

   右下象限 (Annexin V+/PI-)： 早期凋亡细胞。

   右上象限 (Annexin V+/PI+)： 晚期凋亡或坏死细胞。

   左上象限 (Annexin V-/PI+)： 通常为机械损伤细胞或坏死细胞。

注意事项  

1.  避光操作： 整个实验过程，尤其是孵育步骤，必须在避光条件下进行，以防荧光染料淬灭。

2.  避免膜损伤： 处理细胞（如消化、吹打、离心）时务必轻柔，避免人为造成细胞膜损伤，导致假阳性结果。

3.  设置对照： 实验必须设立以下对照，否则结果无法判读：

       未染色细胞管： 用于调节电压和设门。

       单染管 (仅Annexin V)： 用于荧光补偿调节。

       单染管 (仅PI)： 用于荧光补偿调节。

4.  及时检测： 染色后的细胞应尽快（1小时内）上机检测，以免随时间推移细胞状态发生变化。

5.  钙离子依赖： Annexin V的结合是钙离子依赖性的，因此必须使用试剂盒提供的含有Ca²⁺的结合缓冲液。

6.  PI的毒性： PI是一种潜在的致癌物，操作时应佩戴手套，并按照有害化学品废弃物处理规定处理废液和细胞。

7.  贴壁细胞： 消化贴壁细胞时，胰酶消化时间不宜过长，且最好使用不含EDTA的胰酶，因为EDTA会螯合Ca²⁺，影响Annexin V的结合。  

常见问题解答  

Q1: 为什么我的细胞Annexin V和PI双阳性的比例特别高？

   A: 可能原因包括：① 细胞处理过程过于剧烈，导致大量细胞坏死；② 诱导凋亡的刺激过强或时间过长，细胞已进入晚期凋亡；③ 胰酶消化时间过长。建议优化细胞处理流程和诱导条件。

Q2: 流式图上细胞分群不明显怎么办？

   A: ① 首先检查电压设置是否合适，可用未染色管调节。② 必须进行单染管补偿调节，去除荧光渗漏的影响。③ 细胞状态不佳或碎片过多也会导致分群不清，建议在检测前用细胞筛过滤样本。

Q3: 能否用其他缓冲液（如PBS）代替结合缓冲液？

   A: 不能。 Annexin V的结合需要Ca²⁺，而普通的PBS不含Ca²⁺，会导致结合失败或信号微弱。必须使用试剂盒提供的或自配的含Ca²⁺的缓冲液。

Q4: 实验结果没有凋亡细胞信号是什么原因？

   A: ① 诱导凋亡不成功，需确认诱导剂浓度和作用时间。② 细胞收集过程中凋亡细胞已丢失（凋亡细胞可能漂浮在培养基中，需一并收集）。③ 操作过程中染料失效或未添加成功。

Q5: 该试剂盒可以用于固定后的细胞吗？

   A: 不建议。 细胞固定会破坏细胞膜结构，导致PI非特异性染色，并使Annexin V无法正常结合PS，实验结果不可靠。该检测应针对新鲜、未固定的细胞进行。

Q6: 除了流式细胞仪，还能用什么设备检测？

   A: 本试剂盒也可用于荧光显微镜观察。染色步骤相同，最后将细胞悬液滴到载玻片上盖上盖玻片即可观察。在荧光显微镜下，活细胞无荧光；早期凋亡细胞仅有绿色膜荧光；晚期凋亡/坏死细胞同时有绿色膜荧光和红色核荧光。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。