Fluo-4钙离子检测试剂盒，LK-3608

产品介绍  

Fluo-4 AM钙离子检测试剂盒是一种用于检测活细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]i）变化的高灵敏度、高性能工具。Fluo-4是一种对钙离子高度敏感的荧光染料，其乙酰甲酯（AM）形式具有细胞膜渗透性，可轻松进入细胞。进入细胞后，细胞内的酯酶会将Fluo-4 AM水解为Fluo-4，后者无法穿透细胞膜而被滞留在细胞内。当Fluo-4与胞内钙离子结合后，其荧光强度会显著增强（通常可达100倍以上）。通过荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪等设备监测荧光强度的变化，即可实时、定量地检测细胞内钙离子浓度的动态波动。

本试剂盒广泛应用于G蛋白偶联受体（GPCR）研究、离子通道功能研究、神经信号转导、药物筛选、细胞凋亡以及心血管疾病研究等多个领域。

产品特点  

1.  高灵敏度： Fluo-4与钙离子结合后，荧光强度显著增强，信噪比高，能够检测到微弱的钙信号。

2.  优异的细胞负载能力： Fluo-4 AM具有良好的细胞膜渗透性和负载效率，适用于多种类型的贴壁细胞和悬浮细胞。

3.  兼容性广： 其最佳激发/发射波长（~494 nm/~516 nm）与常用的FITC检测通道兼容，适用于大多数荧光检测设备。

4.  即用型试剂盒： 本试剂盒提供了优化的负载缓冲液和检测缓冲液，简化了实验流程，方便快捷。

5.  适用于实时动态监测： 可用于检测细胞内钙离子浓度的快速、瞬时变化。  

使用方法（仅供参考）  

实验前准备：将试剂盒各组分从-20°C冰箱取出，置于冰上或室温下缓慢融化。Fluo-4 AM干粉或DMSO溶液需避光。准备好生长状态良好的细胞（贴壁细胞或悬浮细胞）。预热细胞培养箱、离心机等设备。配制好实验所需的刺激物（如：ATP、Carbachol等）和缓冲液。

操作步骤：

1. Fluo-4 AM工作液的配制：取出一管Fluo-4 AM（如为干粉，先用高质量无水DMSO溶解，配制为1-5 mM的储存液）。根据实验用量，用本试剂盒提供的负载缓冲液 稀释Fluo-4 AM储存液，配制成为1-5 µM的工作液。注意： 工作液需现用现配，并避免保存。建议加入0.02%-0.05%的Pluronic F-127以帮助染料分散，减少在培养基中形成聚集体。

2. 细胞负载：

2.1 贴壁细胞： 移去细胞培养液，用预温的PBS或HBSS轻轻洗涤细胞1-2次。加入适量Fluo-4 AM工作液，确保完全覆盖细胞。在37°C，5% CO₂培养箱中避光孵育30-60分钟。

2.2 悬浮细胞： 离心收集细胞，用预温的PBS或HBSS重悬洗涤一次。用Fluo-4 AM工作液重悬细胞，在37°C，避光孵育30-60分钟，期间可轻柔摇动。

3. 洗涤与平衡：孵育结束后，移去染料工作液。用预温的负载缓冲液或检测缓冲液 洗涤细胞2-3次，以彻底去除细胞外未进入的染料。加入新鲜的缓冲液，在37°C下避光继续孵育20-30分钟，以确保细胞内的酯酶将AM基团完全水解，此步骤对于获得稳定的基线至关重要。

4. 荧光检测：将负载好的细胞置于荧光显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪中进行检测。激发波长： 约494 nm，发射波长： 约516 nm。首先记录一段时间的基线荧光信号（F₀），待信号稳定后，加入钙离子激动剂或待测药物，并持续记录荧光强度的变化（F）。

5.数据分析： 相对荧光强度变化通常表示为 ΔF/F₀ 或 F/F₀。

注意事项  

1.  避光操作： Fluo-4 AM对光敏感，从配制到检测的全过程都必须在避光条件下进行。

2.  防止染料泄露： 某些细胞系（如Jurkat）存在多药耐药蛋白，会主动将染料泵出细胞。可考虑在负载和检测过程中使用维拉帕米等抑制剂，或使用本试剂盒推荐的专用缓冲液。

3.  细胞状态： 确保细胞活性良好，过度消化或状态不佳的细胞会影响染料负载效率和实验结果。

4.  染料浓度与孵育时间： 最佳的染料浓度和孵育时间因细胞类型而异，建议通过预实验进行优化，避免染料过载产生的细胞毒性和淬灭现象。

5.  试剂解冻： Fluo-4 AM储存液应分装冻存，避免反复冻融。工作液必须现用现配。

6.  对照设置： 实验务必设置阴性对照（未染色细胞）和阳性对照（已知有效的钙离子激动剂，如离子霉素），以确保实验体系有效。

7.  个人防护： 请穿着实验服并佩戴手套进行操作。  

常见问题解答  

Q1: 为什么我的荧光信号很弱或无信号？

   原因可能： 染料浓度过低或孵育时间不足；细胞活性差；细胞类型不易负载染料；酯酶活性低；检测设备参数设置不当。

   解决方案： 优化染料浓度和孵育时间；确保细胞状态良好；尝试加入Pluronic F-127；延长水解时间；检查仪器光路和设置。

Q2: 为什么基线不稳定，持续上升或下降？

   原因可能： 洗涤不彻底，细胞外残留染料；染料发生淬灭；细胞状态不佳，持续泄漏染料；水解时间不足。

   解决方案： 增加洗涤次数；确保全程避光；使用健康的细胞并优化实验条件；确保足够的水解平衡时间。

Q3: 为什么加入刺激物后没有响应？

   原因可能： 刺激物失效或浓度不当；细胞表面缺乏相应的受体；细胞内钙库已耗竭；缓冲液中含钙离子（对于研究内质网释放钙的实验，需使用无钙缓冲液）。

   解决方案： 验证刺激物的活性并尝试不同浓度；确认细胞模型表达目标受体；使用阳性对照（如离子霉素）验证检测系统是否正常；根据实验目的选择合适的缓冲液。

Q4: 背景荧光过高怎么办？

   原因可能： 细胞外染料洗涤不干净；细胞死亡释放染料；培养基中的酚红等成分会产生自发荧光。

   解决方案： 彻底洗涤；确保细胞活性；使用无酚红的缓冲液进行负载和检测。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。