小鼠Ⅰ型原胶原N端前肽（PINP）检测试剂盒，E212844

产品编号：E212844

英文名称：Mouse PINP Assay Kit, E212844

产品仅供科研使用

用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中小鼠Ⅰ型原胶原N端前肽（PINP）

使用本产品之前，必须完整阅读本说明书。仅供科研使用，不能用于临床诊断或治疗。

一、背景简介

Ⅰ型原胶原N端前肽（PINP）是Ⅰ型原胶原在合成过程中，由蛋白酶切割其N末端后释放入血的多肽片段。Ⅰ型胶原是骨基质中最丰富的蛋白质，占骨有机成分的90%以上。在骨形成过程中，成骨细胞合成Ⅰ型原胶原，其N端和C端的前肽被特异性蛋白酶切除后释放入血液循环，成熟的Ⅰ型胶原分子则组装到骨基质中。因此，PINP是反映骨形成活性的特异性标志物，其血清水平与骨形成速率呈正相关。PINP在临床和基础研究中被广泛用于监测骨代谢疾病（如骨质疏松症、佩吉特病、骨软化症）的治疗效果、评估骨折风险以及研究药物对骨代谢的影响。与骨吸收标志物联合检测，可全面评估骨转换状态。本试剂盒小鼠PINP免疫测定是一种三步法固相夹心ELISA，用于测量细胞培养上清液、血清和血浆中的小鼠PINP。试剂盒包含大肠杆菌表达重组小鼠PINP和针对重组蛋白产生的抗体。使用天然小鼠PINP获得的结果显示出与使用重组标准品获得的标准曲线平行的线性曲线。这些结果表明，该试剂盒可用于测定天然小鼠PINP的相对质量值。

二、检测原理

试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物PINP，孵育清洗后，再加入生物素标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色液后，若样本中有待测物则显蓝色，则加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中PINP的浓度。

三、操作要点

1. 混合蛋白质溶液时，应始终避免起泡。

2. 为了避免交叉污染，在添加每个标准品、样品和试剂时应更换移液器枪头。此外，每种试剂应单独使用容器。

3. 确保试剂不间断地添加到板孔中。为了确保准确的结果，在孵育步骤中需要粘合好封板膜。

4. 当使用自动洗板机时，在加入洗涤缓冲液后加入30秒的浸泡期，或者在洗涤步骤之间将板旋转180度，可以提高测定精度。

5. 显色剂应保持无色，直到添加到板中。确保显色剂不受光线照射。显色剂应从无色变为蓝色。

6. 应按照与显色剂相同的顺序将终止液添加到板中。加入终止液后，孔中形成的颜色将从蓝色变为黄色。绿色的孔表示终止液未与基质溶液充分混合。

四、试剂盒组成及储存条件

1. 预包被酶标板（48T：8×6条；96T：8×12条）：未用完的酶标板密封干燥保存于2-8℃可储存至多1个月。

2. 标准品（48T：100μL；96T：200μL）：每次测试按需配置，剩余置于2-8℃储存至多6个月。

3. 100×生物素化抗体（48T：50μL；96T：100μL）：每次测试按需配置工作液，剩余置于2-8℃储存至多6个月。

4. 100×SA-HRP（48T：50μL；96T：100μL）：每次测试按需配置工作液，剩余置于2-8℃储存至多6个月。

5. 20×浓缩稀释液（48T：15mL；96T：25mL）：置于2-8℃可保存至有效期末。

6. 显色剂A（48T：3mL；96T：6mL）

7. 显色剂B（48T：3mL；96T：6mL）

8. 终止液（48T：3mL；96T：6mL）

9. 20×浓缩洗涤液（48T：15mL；96T：25mL）

10. 封板胶纸（48T：2张；96T：2张）

11. 产品说明书（48T：1份；96T：1份）

五、需要的其他材料

- 酶标仪（包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳）

- 移液器及枪头

- 蒸馏水或去离子水

- 100-1000 mL刻度量筒

- 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机

- 水平轨道微孔板振荡器（500±50 rpm）

- 用于稀释标准品和样品的试管

六、注意事项

- 终止液为稀硫酸溶液，具有一定腐蚀性，应谨慎操作。

- 某些成分含有防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，应佩带口罩避免吸入薄雾。

- 显色剂B可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激，应佩带口罩避免吸入薄雾。

- 佩戴防护手套、防护服、眼睛和面部防护用品，处理后彻底洗手。

七、样品预处理

1. 细胞培养上清液：1000×g离心15分钟去除颗粒，立即测定或分装储存在≤-20℃，避免反复冻融。

2. 血清：使用血清分离管，室温凝结30分钟，1000×g离心15分钟，立即测定或分装储存在≤-20℃。建议2倍稀释（50μL样品+50μL 1×稀释液）。

3. 血浆：使用EDTA或肝素抗凝，收集后30分钟内1000×g离心15分钟，立即测定或分装储存在≤-20℃。建议2倍稀释。柠檬酸盐抗凝剂未经验证。

4. 组织匀浆：PBS冲洗组织，按1:9重量体积比加入PBS（含蛋白酶抑制剂），冰上匀浆或超声破碎，5000×g离心5-10分钟取上清。

5. 细胞裂解液：PBS清洗细胞，每1×10⁶个细胞加150-200μL PBS（含蛋白酶抑制剂），反复冻融或超声破碎，1500×g离心10分钟取上清。

6. 其它样本类型：1000×g离心20分钟取上清。

八、试剂准备

使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟。

1. 洗涤液/稀释液配置：1:20用蒸馏水稀释（如1mL浓缩液+19mL蒸馏水）。

2. 标准品配置：准备7个离心管，用1×稀释液倍比稀释，共7个浓度，1×稀释液作零浓度。

3. 抗体工作液配置：使用前10分钟，用1×稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液。

4. 酶结合物工作液配置：使用前10分钟，用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×工作液。

九、实验步骤

所有标准品、样品建议复孔检测。

1. 酶标板准备：确定所需孔数，取下未使用的酶标条密封保存。

2. 样本孵育：每孔加100μL标准品或样品，盖封板膜，37℃避光反应1.5小时。洗涤3次（每孔300μL 1×洗涤液，晃动30秒后拍干）。

3. 抗体孵育：每孔加100μL生物素化抗体工作液，盖封板膜，37℃避光反应1小时。洗涤4次。

4. 酶标孵育：每孔加100μL 1×SA-HRP工作液，盖封板膜，37℃避光反应30分钟。洗涤4次，拍干。

5. 底物显色：每孔先加50μL显色液A，再加50μL显色液B，轻轻混匀，盖封板膜，37℃避光反应15分钟。

6. 终止反应：每孔加50μL终止液，轻轻混匀，5分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

实验步骤汇总：

加标准品及样品 → 37℃避光1.5h，洗涤3次 → 加生物素化抗体 → 37℃避光1h，洗涤4次 → 加酶结合物 → 37℃避光30min，洗涤4次 → 加显色液 → 37℃避光15min → 加终止液 → 5分钟内读数。

十、结果的计算

计算标准品和样本复孔的平均OD值，减去空白孔OD值作为校正值。以浓度为横坐标，校正OD值为纵坐标，绘制四参数逻辑函数标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时乘以稀释倍数。

十一、灵敏度

详见批次纸质说明书。

十二、线性关系

1:2稀释：血清82-96%，血浆88-102%，细胞培养上清90-108%

1:4稀释：血清85-100%，血浆86-104%，细胞培养上清94-112%

1:8稀释：血清84-98%，血浆89-103%，细胞培养上清92-110%

十三、特异性

该试剂盒可识别天然和重组小鼠PINP。其他相关蛋白（50ng/mL）无明显交叉反应。

十四、产品声明

1. 用途限制：本产品仅限于专业人员的科学研究使用，不得用于临床诊断、治疗、食品、药品或存放于普通住宅内。

2. 实验风险告知：由于科研实验本身具有探索性、未知性和多变量特性，若实验涉及珍贵样本，请务必自行开展小规模预实验，确认本产品效果满足实验要求后，再应用于大批量关键实验。

3. 售后范围：本产品售后服务仅限产品本身质量问题，对于因使用本产品造成的任何间接损失、样本损耗或数据偏差，本公司不承担任何连带责任。购买即视为同意此条款。

4. 安全操作：为了您的安全与健康，操作时请穿实验服并佩戴一次性手套。