免疫沉淀磁珠 ProteinA/G（LK-6258）

产品介绍

Protein A/G免疫沉淀磁珠采用生物纳米表面技术，将Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，专为免疫沉淀实验设计。本品适用于从细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等多种样品中高效捕获目标抗原，广泛应用于IP、Co-IP和CHIP等实验。

产品特点

1.高结合效率:每毫升磁珠可结合≥0.4 mg Human IgG，单个反应仅需20-25ul磁珠  

2.低非特异性吸附:优化的表面处理技术显著降低背景干扰  

3.操作简便灵活:支持变性与非变性两种洗脱方式  

4.兼容性强：广谱抗体种属兼容性  

产品信息

磁珠浓度：10 mg/mL

保存条件：4℃保存，有效期2年

保存溶剂：1×PBS含0.1% BSA和0.1% proclin-300

自备缓冲液（参考配方）

结合缓冲液 Binding Buffer：1×PBS, 1% (v/v) TritonX-100, 0.01% (v/v) NP-40, 5% (v/v) Glycerol

结合缓冲液可以根据实验室实验习惯，自行选择（一般推荐有PBST、IP裂解液或者TBST简易替代亦可，由于IP蛋白性质的多样性，具体结合缓冲液请结合实验效果优化。）

洗涤缓冲液 Washing Buffer：50 mM Tris-HCl, 0.1% (v/v) Tween-20, pH7.5

洗脱缓冲液 Elution Buffer：0.1M Glycine, 0.1% (v/v) Tween-20, pH2.5（仅仅洗脱法用）

中和缓冲液：Neutralization Buffer 0.1M Tris-HCl, pH 9.0（仅仅洗脱法用）

实验步骤（仅供参考）

1. 抗原样品制备

根据抗原样品来源选择适当的预处理方式：

1.1 血清样品：用Binding Buffer将血清样品稀释至目标蛋白终浓度为10~100ug/mL，置于冰上备用或于-20℃保存。

1.2 悬浮细胞样品：离心收集细胞（4℃, 500 g, 10 min），弃上清后用1×PBS洗涤两次。按每毫克细胞5~10ul的比例加入Binding Buffer和蛋白酶抑制剂，冰上孵育10 min后离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min）。

1.3 贴壁细胞样品：用1×PBS洗涤细胞两次，刮取细胞后按每1.0×10^5个细胞20~30ul的比例加入Binding Buffer和蛋白酶抑制剂，冰上孵育10 min后离心收集上清液（4℃, 14000 g, 10 min）。

1.4 大肠杆菌样品：离心收集菌体（4℃, 12000 g, 2 min），用1×PBS洗涤两次后按每克菌体5~10 mL的比例加入Binding Buffer和蛋白酶抑制剂，超声裂解后离心收集上清（4℃, 17000 g, 10 min）。

2. 磁珠预处理

2.1 振荡磁珠1 min使其重悬，取25~50ul磁珠悬液放入1.5 mL EP管中。

2.2 加入200ul Binding Buffer洗涤，磁性分离1 min后吸去上清液。重复洗涤一次。

2.3 加入200ul Binding Buffer重悬磁珠备用。

3. 抗体结合反应

3.1 将抗体用Binding Buffer稀释至5~50ug/mL，制备抗体工作液。

3.2 将预处理的磁珠进行磁性分离，吸去上清液后加入200ul抗体工作液，室温翻转混合15 min。

3.3 磁性分离后收集上清液，用200ul Binding Buffer洗涤两次。

4. 抗体交联反应（可选）

如需单独洗脱目标抗原，可使用BS3交联剂（参照试剂说明书操作）。

5. 抗原沉淀反应

5.1 加入200ul抗原样品，室温翻转混合10 min（或延长孵育时间）。

5.2 磁性分离后收集上清液，用200ul Washing Buffer洗涤三次，最后将复合物转移到新EP管中。

6. 抗原洗脱

选择以下一种洗脱方法：

6.1 变性洗脱法：加入25ul 1×SDS-PAGE Loading Buffer，95℃加热5 min，离心后收集上清液用于SDS-PAGE。

6.2 非变性洗脱法：加入20ul Elution Buffer，室温孵育10 min，离心后收集上清液并加入1.0ul Neutralization Buffer中和。

注意事项

1. 避免冷冻磁珠，应保存在储存溶液中防止干燥。

2. 每次磁性分离时间不少于1 min以减少磁珠损失。

3. 使用前充分震荡磁珠使其均匀悬浮，避免产生气泡。

4. 使用高质量移液器吸头和反应管以减少磁珠损失。

5. 选择特异性强的抗体进行免疫沉淀反应。

6. 可根据实验需求检测抗体、抗原与磁珠的结合情况。

7. 若推荐缓冲体系效果不佳，可自行筛选和配制缓冲液。

8. 本产品仅用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗。

9. 操作时请穿实验服并戴一次性手套。

常见问题及对策

1.如何提高抗体与磁珠结合效率?                                            

磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关，请确认抗体的类型与Protein A/G配基的亲和效率。如抗体所属亚型与Protein A/G的亲和度较低，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间（30～120 min）、提高结合缓冲液的pH值（8-9）及降低离子强度（25-100 mM NaCl）等方法提高亲和效率。

2.如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?                        

先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用Protein A/G磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

3. 如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？    

磁珠应保存在2～8℃，使用时应避免由于污染而导致的不可逆  聚集，或因干燥而导致的聚集。磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在Binding buffer和Elution buffer中添加终浓度为0.1%(v/v)的非离子型去垢剂（如NP-40、Tween-20或Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1%(v/v) Tween-20的Tris buffer(pH 7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

4. 如何解决磁珠易粘附管壁的现象？                                      

建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%～0.1%(v/v)的非离子型去垢剂（如NP-40、Tween-20或Triton X-100）可以有效降低磁珠对耗材的粘附。

5. 磁珠在使用过程中出现结块现象 ？

磁珠在使用时如果出现结块现象一般较难振荡打散，容易导致分布不均，出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠使其重新分散，但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠 在加样后洗脱前不宜使用该方法。

产品声明

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.我公司所有产品仅限科学研究实验使用，严禁其他用途，因用于其他用途引起的人身财产安全事故，本公司概不负责。

3.由于科研实验本身存在不确定性和失败风险，对于珍贵样本务必谨慎使用，或者使用前请用普通样本做预实验，确保实验条件和方案成熟，以免对珍贵样本造成不可挽回的浪费和其他实验损失。产品如遇质量问题，售后仅限产品本身，不涉及连带其他任何赔偿。

4.介于科研实验的样本类型复杂性，实验因素多样性，本产品提供的产品说明书仅供参考，如所需实验与本说明书提供的实验信息不一致，请自行查阅文献。