Edu-488 细胞增殖检测试剂盒，CS1309

产品介绍

测量细胞增殖和细胞周期是评估细胞健康、确定遗传毒性和评估药物药效的基本方法, 常用的方法是直接测量DNA 的合成。在以往的实验中常用方法包括掺入放射性核苷 (3H-thymidine )或BrdU等。而EdU Imaging Kits (488)则 采用了一种新的方法:点击化学-CuAAC  (铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应),使用该反应可直接测量在细胞周期S期的DNA合成。

在基于BrdU的检测中, 需要额外的DNA变性(通常使用HCl、加热或用DNase消化) 以使BrdU暴露于抗BrdU抗体。胸腺嘧啶核苷类似物EdU (5-ethynyl-2 , -deoxyuridine )是BrdU的理想替代品, 因为它不受苛刻的DNA变性条件的影响, EdU可以在DNA合成过程中掺入DNA链中。EdU的炔基是一种生物惰性基团, 可以通过CuAAC反应与染料的叠氮基发生极强的选择性反应,从而生成1, 2, 3-三唑产物。EdU和6-FAM Azide具有生物学上独特的基团,其连接后可以荧光标记增殖细胞的DNA,具有低背景和高检测灵敏度。这种CuAAC反应可在极温和的条件下提供出色 的区域选择性和定量转化。该反应是高效的,并且可以通过流式细胞术或荧光显微镜定量地使用。

EdU Imaging Kits (488)  采用的是6-FAM Azide与EdU进行连接后荧光标记增殖细胞的DNA,可通过荧光显微镜进行观6-FAM Azide最大激发波长为496 nm,最大发射波长为516 nm 。

产品组分

实验步骤

实验操作

1.  试剂准备

1.1 室温下将试剂盒的各组分解冻完全。

1.2 配制10 mM EdU储存液: 向Component A中加入2 mL DMSO  (Component C ) 或水溶液 (PBS、生理盐水等缓冲液) 并充分混合。配制的10 mM EdU储存液可在-20ºC稳定保存1年。

1.3 配制6-FAM  Azide储存液 : 将Component  B  12000  rpm离心1  min使其粉末都汇集到管底, 随后向Component B中加入25 μ L DMSO  (Component C ) 并充分混合,即为6-FAM Azide储存液。

1.4 配制 1X EdU Reaction Buffer: 将4 mL Component D溶液加入到 36 mL ddH2O中  可通过使用一些稀释的1X EdU Reaction Buffer冲洗D瓶以确保转移所有的10X EdU Reaction Buffer), 如若一次实验只需配制少量的1X EdU Reaction Buffer,则可用ddH2O按照1:10的比例稀释Component D 中的溶液。配制好的1X EdU Reaction Buffer在2-6。C条件下可稳定保存长达6个月。

1.5 配制10X EdU Buffer Additive储存液: 向Component F中加入2 mL的ddH2O,并充分混合直至EdU Buffer Additive完全溶解。配制好的10X EdU Buffer Additive储存液在-20ºC条件下可稳定保存1年; 如果储存液呈棕色,则说明已降解,应立即丢弃。

1.6其他需要 自备的试剂 (本试剂盒不提供):

1X PBS  (pH 7.2-7.6)；洗涤液 (如含3% BSA的PBS)；固定液(如含4%多聚甲醛的PBS)；通透液(如含0.3% Triton X- 100的PBS)

2.EdU标记细胞

2.1 将适量细胞接种于 6 孔板中 (如有必要可以加入盖玻片), 待细胞培养过夜并且恢复到正常生长状态, 可根 据实验需要进行药物等处理。

2.2 将事先配制的 10 mM EdU 储存液用完全培养基稀释成 2X EdU 工作液(如所需要的 EdU 终浓度为 10 μM ,

则用完全培养基先稀释成 20 μM 的 2X EdU 工作液)。

*Note:设置实验组时可以考虑增加一个不添加 EdU 但同步进行点击反应的组作为阴性对照,以排除染料非特异性染色的干扰。

2.3 37ºC 培养箱预热 2X  EdU 工作液,然后等体积加入到含有细胞的 6 孔板中, 使6 孔板中的 EdU 终浓度变

为 1X  (如所需 EdU 工作液的终浓度为 10  μM,则用含 20  μM 的 EdU 新鲜培养基替换掉一半的培养基); 并不建议更换所有培养基,因为这可能会影响细胞增殖速率。

2.4 继续孵育细胞一定时间。孵育时间的长短取决于细胞生长速率, 通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间,

如常见的细胞系HeLa 、HEK293等,细胞周期大约在18-25小时,则EdU孵育时间在2小时左右。

*Note:因细胞类型、细胞密度、细胞增殖速度等的不同均会影响 EdU 掺入到细胞中的量, 因此建议在初始实验时, 测试一系列的 EdU使用浓度,以确定适合您的细胞类型和实验条件的最佳浓度。如果您之前使用过基于 BrdU 的细胞增殖检测方法, 则可以参考 BrdU 的终浓度作为 EdU 的终浓度。

3. 固定和通透

3.1 EdU  孵育完成后,去除培养基, 每个孔中加入 1  mL 含 4%多聚甲醛的 PBS  (或其它固定液), 室温下固定 15 min。

3.2 去除固定液,然后每个孔用 1 mL含 3% BSA 的 PBS 洗涤细胞,洗涤2次, 每次 3-5 min。

3.3 去除洗涤液,向每个孔中加入1 mL 含 0.3% Triton X- 100 的 PBS(或其它通透液),室温下孵育10- 15 min。

4. 点击反应

4.1 通透结束后离心去除细胞中的通透液,并用 1 mL 含 3% BSA 的 PBS 洗涤细胞 2 次。

4.2 将配制的 10X EdU Buffer Additive储存液用去离子水按 1:10稀释配制成 1X EdU Buffer Additive工作液(该 工作液需现用现配)。

4.3 参考下表配制 Click 反应液  需完全按照下表中的组分顺序和体积配制 Click 反应液, 否则点击反应可能无法有效地进行);同时, 配制的 Click 反应液必须在配制后的 15 min 内使用。

4.4 离心除去洗涤液, 每孔加入 500  μL  Click 反应液 (您可以根据之前的实验需要调整 Click 反应液的体积),轻轻摇晃培养板以确保 Click 反应液均匀分布覆盖样品, 室温避光孵育 30 min。

4.5 吸去Click反应液,用1 mL含3% BSA的PBS洗涤每孔3次, 每次3-5 min。

4.6 如果需要对细胞核进行染色,可以参照下述步骤进行。如无其它的特殊需要,即可在荧光显微镜下观察。

4.7 可选步骤:若同时需用抗体对样品进行标记, 则在孵育过程中保持避光非常重要。

5.细胞核染色

5.1 1X Hoechst 33342溶液配制: 将Hoechst 33342  (Component G) 溶液用PBS按1:2000的比例稀释,即可

得到1X Hoechst 33342溶液(终浓度为5 μg/mL )。

5.2 每孔加入1 mL 1X Hoechst 33342溶液,室温避光孵育15 min。

5.3 除去Hoechst 33342溶液。

5.4 每孔用1 mL PBS洗涤3次, 每次3-5 min。

6.成像分析

6-FAM Azide 的最大激发波长为496 nm,最大发射波长为516 nm。Hoechst 33342为蓝色荧光,最大激发波长为350 nm,最大发射波长为461 nm。同时可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的染色。