Annexin Dylight 647/7-AAD凋亡检测试剂盒，LK-2506

Annexin Dylight 647/7-AAD Apoptosis Kit

产品介绍

Annexin Dylight 647/7-AAD Apoptosis Kit 用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。

- Annexin V：一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力。细胞凋亡时，PS从膜内侧外翻到膜表面，被荧光染料 Dylight 647 标记的 Annexin V 结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测。

- 7-AAD：7-氨基放线菌素 D，可与双链 DNA 结合并产生强烈荧光，用于区分凋亡晚期或坏死细胞。与 Annexin V 搭配使用，可区分不同凋亡时期的细胞。

保存条件

- 温度：2~8°C，保存期限：1年，禁止冷冻保存。

试剂配制

- 1×Annexin V Binding Buffer：取 1 mL Annexin V Binding Buffer (10×) 加入 9 mL 去离子水中混匀。

实验操作（参考）

一步法

1. 细胞处理：诱导凋亡后，300×g 离心 5 分钟，弃上清，收集细胞。用 PBS 洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2. 细胞重悬：取 1~5×10⁵细胞，300×g 离心 5 分钟，弃上清。用 PBS 洗涤一次，离心后弃上清，加入 500ul 1×Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。

3. 染色：加入 5ul Annexin Dylight 647 Reagent 和 5ul 7-AAD Reagent (100 μg/mL)。

4. 孵育：轻柔涡旋混匀，室温避光孵育 15~20 分钟。

5. 检测：立即上机检测。若不能及时检测，冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。流式细胞仪通道：Annexin Dylight 647 用 APC 通道，7-AAD 用 PerCP/Cy5.5 通道。

两步法

1. 细胞处理：同一步法。

2. 细胞重悬：取 1~5x10⁵ 细胞，300 ×g 离心 5 分钟，弃上清。用 PBS 洗涤一次，离心后弃上清，加入 100ul 1×Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。

3. 染色：加入 2.5ul Annexin Dylight 647 Reagent 和 2.5ul 7-AAD Reagent (100 μg/mL)。

4. 孵育：轻柔涡旋混匀，室温避光孵育 15~20 分钟。

5. 缓冲液添加：加入 400ul 1×Annexin V Binding Buffer，混匀样本。

6. 检测：立即上机检测。若不能及时检测，冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。

流式细胞仪通道：Annexin Dylight 647 用 APC 通道，7-AAD 用 PerCP/Cy5.5 通道。

注意事项

1. 光谱重叠：APC 和 PerCP/Cy5.5 的发射光谱有一定重叠，需进行荧光补偿（Compensation）以消除干扰。确保流式细胞仪配备了相应的激光器和滤光片：APC 通道通常使用 640 nm 激光器，660/20 nm 滤光片。PerCP/Cy5.5 通道通常使用 488 nm 激光器，670/14 nm 滤光片。

2. 贴壁细胞检测：需收集诱导凋亡后的悬浮细胞，并与贴壁细胞一起检测。

3. 消化贴壁细胞：避免机械损伤，胰酶消化液中尽量不含 EDTA，以免影响 Annexin V 与 PS 的结合。

4. EDTA 处理：若使用含 EDTA 的胰酶，收集细胞后应充分清洗，确保 EDTA 被去除。

5. 染色后检测：尽快检测，时间过长可能导致凋亡或坏死细胞数量增加。

6. 荧光物质：易淬灭，操作和存放时注意避光，观察时尽量缩短时间。

7. 安全操作：穿实验服并戴一次性手套。

8.本产品仅供科研实验，严禁其他用途。