线粒体 DNA 提取试剂盒,LK-3289

产品简介

线粒体 DNA 提取的关键是尽可能的去掉核 DNA。本试剂盒利用差速离心到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于 PCR 等对纯度要求较高的实验。本试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞线粒体 DNA 的提取制备。不适合植物及其他标本的提取。

产品规格组分

操作步骤（仅供参考）：

准备工作：在 DNA 酶 I 中加入 600μL（50T）或者 1100μL（100T）的 DNA 酶反应液，适当

分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀 37℃水浴溶解，离心机温度下降到 4℃

（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为 10min 的改为 5min，但最

后所得 DNA 品质及产量可能会有一定影响。

1. 样本处理

a.组织匀浆：称取 100~200mg 新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS 或生理盐水冲洗，洗净

血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入 1.0mL 冰预冷的细胞裂解

液，0℃冰浴上下研磨组织 20 次；

b.培养细胞匀浆：消化细胞，PBS 洗涤，800×g 离心 5~10min，收集细胞。计数。每次提取

需要 5×107 个细胞，加入 1.0mL 冰预冷的细胞裂解液重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻

璃匀浆器内，0℃冰浴研磨 30~40 次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000×g 离心 5min；

3. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，1000×g 再次离心 5min。

4. 取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g 离心 10min。离心后的上清含胞浆成分，可

从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入 0.5mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g 离心 5min；

6．取上清，加入一新的离心管中，4℃，12,000×g 离心 10min。弃上清，高纯度的线粒体沉

淀在管底；

7. 加入 100μL DNA 酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入 10μL DNase I 溶液（见准备

工作），混匀，37℃水浴 10min。此步为消化线粒体表面吸附的核 DNA。4℃，12,000×g 离

心 5min。尽可能的弃上清，再加入 200μL TE 缓冲液重悬线粒体沉淀，离心，洗去残留的 DNA

酶。

8. 得到的沉淀，用 200μL TE 缓冲液重悬线粒体沉淀。加入 10μL RNase A。加入 200μL 线粒

体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置 1-2min 左右，不超过 5min，再加入 150μL 蛋白沉

淀液，迅速混匀。4℃，12,000×g 离心 5min。此步骤可进一步去除核 DNA。

9．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：可选用等体积的酚氯仿异

戊醇 25:24:1 抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提两次，一般来说，此步可去

掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体 DNA 的损失，因而用于 PCR 时可省，并不影响后

续实验），加入 0.6 倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入 2.5 倍体积的乙醇沉淀 DNA，如

离心管太满可分两管）及 5-10μL 核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），

4℃，12,000×g 离心 10min。

10. 弃上清，再加入 1mL 70%乙醇清洗，4℃，12,000×g 离心 10min。重复用 70%乙醇洗一次。

11. 弃上清，再次离心 1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约 5-10min。

12．加入 20-30μL TE 缓冲液，轻弹管底，37℃水浴 5 分钟，线粒体 DNA 溶解。

13. 进行 DNA 电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

保存条件

2-8℃，有效期 12 个月。DNase I 和 RNase A 于-20℃保存。线粒体裂解液使用前常温保存

注意事项

1. 为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：第一是全程低温操作。第二是快速。

第三，如用条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培

养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上

下研磨培养细胞。

2. 线粒体 DNA 本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的 TE 缓冲液溶

解沉淀，或者直接进入 PCR 检测。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 以离心力 g 计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

附：一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。

转速与离心力换算

G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]2

G 为离心力，一般以 g（重力加速度）的倍数来表示；

[rpm]2 即：转速的平方；R 为半径，单位为厘米