组织透明化试剂盒，LK-7007

产品介绍

组织透明化试剂盒通过试剂（如CUBIC-1）的氨基醇成分（如氨基丁醇）溶解血红素，消除红色干扰，提升荧光信号信噪比。使用去垢剂（如Triton X-100）或尿素溶液清除脂质，减少光散射，适用于脑、肝脏等高脂组织。CUBIC-2等后续试剂通常含高折射率物质（如蔗糖、碘化物或山梨醇），通过渗透调节使组织折射率接近1.45-1.52（与显微镜物镜油接近），减少光散射。支持多种标记方法（抗体染色、荧光蛋白、化学染料），且对RNA/DNA保存较好，可结合原位杂交或多组学分析。

操作流程简化示例：以小鼠脑透明化为例，4%多聚甲醛灌注固定。CUBIC-1浸泡1-2周（37℃加速处理）。CUBIC-2浸泡1周至透明。染色成像。

用途广泛：可以用于观察转移灶在全身分布（如结合荧光标记的循环肿瘤细胞）。神经退行性疾病：全脑β-淀粉样斑块三维定位。胚胎整体透明化后追踪器官形成（如心脏发育动态）。透明化器官+荧光标记药物，量化分布效率。

产品规格

25ml;100ml

实验流程概览

1. 组织制备与固定  

   - 麻醉动物→心脏灌注PBS/肝素→多聚甲醛固定→解剖目标组织→4%多聚甲醛过夜固定。 关键点：确保灌注彻底（肝脏变灰白）、固定充分（pH 7-7.5）。

2. 透明化处理  

脱脂脱色：（1：1纯水稀释）50% 溶液A（CUBIC-1）预处理（4-24小时）→ 100% 溶液A 孵育至透明（每4天换液）。  时间参考：脾/胰（2-3天），肝/肾/脑（1-2周）。  

折光率调节：（1：1PBS稀释） 50% 溶液B（CUBIC-2） 孵育（至样品沉底）→ 100% CUBIC-2 两次（各24小时）。  

免疫荧光染色实验步骤

1.1 一抗孵育

稀释一抗：使用一抗稀释液，按推荐比例稀释。  

孵育条件：37℃ 摇床（60 rpm），避光孵育，对细胞样本，可缩短至 2-4 小时或 4℃ 过夜,。  

调整建议：若信号弱或背景高，可优化一抗稀释比例。  

1.2 洗涤（去除一抗）

洗涤缓冲液：1xWash Buffer  

洗涤次数：6 次，每次 2 小时，室温（可优化：振荡洗涤 5–10 分钟/次，共 6–8 次）。  

1.3 二抗孵育

稀释二抗：使用二抗稀释液，按推荐比例稀释。  

孵育条件：37℃ 摇床（60 rpm），避光孵育 1-2 小时。  

调整建议：若背景高，可增加二抗稀释比例或缩短孵育时间。  

1.4 洗涤（去除二抗）

洗涤缓冲液：1× Wash Buffer  

洗涤次数：振荡洗涤 5–10 分钟/次，共 3–5 次。  

细胞核染色（选做）

1.1 DAPI 孵育

DAPI 工作液：用 1× Wash Buffer 稀释至 0.5-10ug/mL（常用 1ug/mL）。  

孵育条件：37℃ 摇床（60 rpm），避光孵育常规染色仅需 5-30 分钟。  

1.2洗涤（去除多余 DAPI）

洗涤缓冲液：1× Wash Buffer  

洗涤次数：快速洗涤 3×5 分钟。  

关键优化建议

1. 缩短实验周期（适用于细胞样本）：  

一抗：4℃ 过夜（12–16 小时） ；二抗：室温 1–2 小时；DAPI：5–10 分钟 ；洗涤：每次 5–10 分钟，共 3–5 次 。 

2. 降低背景：  

增加 Wash Buffer 中的去垢剂（如 0.1–0.3% Tween-20）  ；封闭步骤：使用 5% BSA 或二抗宿主血清  

3. 特殊样本处理：  

组织切片：增加通透步骤（0.1–0.5% Triton X-100，30 min）  

光敏感样本：全程避光，使用棕色 EP 管  

4. 快速方案（紧急检测）：  

一抗 37℃ 1 小时 → 二抗 37℃ 30 分钟 → DAPI 5 分钟  

总时长约 3 小时（需提高抗体浓度）  

注：首次实验建议设置梯度条件（如不同抗体浓度、孵育时间）以优化染色效果。

常见问题解答（精简版）

1. 组织膨胀：透明化中膨胀均匀，不影响细胞排列，无需特殊处理。  

2. 固定要求：必须固定！新鲜或长期保存（-80℃）的样本均可，但长期固定可能降低免疫染色效果。  

3. 试剂用量：  

   - 全身透明化：200-400ml CUBIC-1+ 100-200ml CUBIC-2。  

   - 器官透明化：至少5倍样本体积的CUBIC-1。  

4. 多器官处理：可同管处理（除胃肠需分开并清除内容物）。  

5. 透明失败原因：  

   - pH>8、脱脂不足、折光率不匹配、老龄动物。  

6. 成像建议：  

   - 短时观察（<1小时）：CUBIC-2中直接成像。  

   - 长时观察：需Mounting Solution（RI=1.467），配套高RI物镜。  

关键注意事项

1. 固定液pH：严格控制在7-7.5，避免过度交联。  

2. 脱脂换液：定期更换CUBIC-1（尤其脂质多的组织如肝/脑）。  

3. 抗体验证：部分抗原可能因透明化丢失，建议预实验验证抗体。  

4. 荧光兼容性：  

   - 适用荧光蛋白：GFP/mCherry等；染料：Alexa Fluor系列/Cy3等。  

   - 二抗孵育时间长，推荐直接使用荧光标记一抗。  

5. 容器选择：普通聚丙烯/玻璃器皿即可，需预留膨胀空间。  

6. 建议针对特定组织类型调整透明化时间（如致密组织延长脱脂）。

7. 抗体渗透：超大样本（如全脑）可能需延长染色时间或辅助电泳（如Active-CUBIC）。

8. 组织变形：透明化可能导致轻微膨胀，需校准3D重建尺度。

9. 试剂毒性：部分配方含尿素，需在通风橱中操作。