shRNA定制合成产品简介
1. 结构与特点
- 发夹结构：shRNA由一条单链RNA组成，通过反向互补序列形成茎环结构（stem-loop），其中：
- 茎部：由互补配对的碱基组成双链区。
- 环部：连接茎部末端的非配对单链区。
- 长度：通常约50-70个核苷酸，茎部序列与目标基因的mRNA互补。
2. 作用机制
shRNA通过细胞内源性RNAi通路沉默基因：
1. 递送至细胞：通过质粒或病毒载体（如慢病毒、腺病毒）导入细胞。
2. 加工为siRNA：细胞内的Dicer酶将shRNA切割成小干扰RNA（siRNA）（约21-23 bp的双链片段）。
3. 形成RISC复合物：siRNA与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，其中一条链被降解，另一条引导RISC靶向互补的mRNA。
4. 降解mRNA：RISC切割目标mRNA，阻断其翻译，从而抑制基因表达。
3. 与siRNA的区别
与siRNA的区别
特征 | shRNA | siRNA |
结构 | 单链发夹结构，需Dicer加工 | 直接合成的双链RNA |
持久性 | 通过载体长期表达，作用持久 | 直接转染，效果短暂（几天） |
递送方式 | 需基因载体（如病毒） | 化学合成，直接转染细胞 |
应用场景 | 长期基因沉默（如稳定细胞系、动物模型） | 短期实验性沉默 |
4. 应用领域
- 基因功能研究：敲低特定基因以研究其功能。
- 疾病治疗探索：如癌症、病毒感染（如HIV）的靶向基因治疗。
- 药物开发：筛选药物靶点或验证基因作用机制。
- 转基因动物模型：构建条件性基因敲除模型。
5. 优缺点
- 优点：
- 持久性：载体整合后可长期表达。
- 高效性：病毒载体递送效率高（尤其在难转染细胞中）。
- 缺点：
- 脱靶效应：可能非特异性抑制其他基因。
- 免疫反应：病毒载体可能激活宿主免疫应答。
- 插入突变风险：载体随机整合可能破坏宿主基因。
6. 设计要点
- 靶序列选择：针对目标mRNA的特异性区域（常用在线工具预测，如NCBI或siRNA设计软件）。
- 载体构建：需包含启动子（如U6或H1）、shRNA序列及标记基因（如荧光蛋白）。
- 对照实验：需设计乱序（scrambled）shRNA作为阴性对照。
7. 相关技术扩展
- CRISPR/Cas9：shRNA通过抑制mRNA实现基因沉默，而CRISPR直接编辑DNA，两者可互补使用。
- miRNA模拟物：天然miRNA与shRNA机制类似，但调控更复杂。
