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  • LK-80809 CUT&RUN m6A RNA Enrichment (MeRIP) Kit

  • LK-80809 CUT&RUN m6A RNA Enrichment (MeRIP) Kit

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产品描述

CUT&RUN m6A RNA Enrichment (MeRIP) Kit,LK-80809

产品概述

- 用途：用于从低输入RNA中富集含有m6A修饰的RNA片段，并通过PCR或高通量测序（如Illumina平台）进行区域特异性或全转录组m6A分析。

- 输入量：推荐10 µg总RNA（范围：1 µg–20 µg；最低可至500 ng）。

- 起始材料：哺乳动物细胞（培养细胞、原代细胞、血液/体液/组织分离的细胞、胚胎细胞等）。

- 抗体：高特异性抗m6A兔多克隆抗体（不与非甲基化RNA片段交叉反应）。

- 特点：高富集效率、低背景、快速流程（约2.5小时）、操作简便。

试剂盒组分列表（24次反应）

组分名称

体积/数量

储存条件（收货后）

关键说明

WB (Wash Buffer)

30 ml

4°C

使用前检查是否有盐沉淀，必要时37℃溶解。

ICB (Immuno Capture Buffer)

5 ml

室温（RT）

直接用于免疫捕获反应。

NDE (Nuclear Digestion Enhancer)

300 µl

室温（RT）

切割反应前加入，增强酶活性。

CEM (Cleavage Enzyme Mix)*

60 µl

-20°C

需离心后使用，避免反复冻融。

m6A Antibody (1 mg/ml)*

50 µl

-20°C

高特异性兔多抗，避免分装冻融。

Non-immune IgG (1 mg/ml)*

20 µl

4°C

阴性对照抗体。

m6A-Positive Control (200 µg/ml)*

6 µl

-20°C

合成含m6A的寡核苷酸，验证实验。

PDB (Protein Digestion Buffer)

5 ml

室温（RT）

蛋白消化缓冲液。

Proteinase K (10 mg/ml)*

100 µl

4°C

需与PDB按1:10混合使用。

Affinity Beads*

100 µl

4°C

使用前涡旋混匀，避免沉淀。

RPS (RNA Purification Solution)

600 µl

室温（RT）

RNA结合磁珠的溶液。

RNA Binding Beads*

60 µl

4°C

需涡旋重悬后使用。

Elution Buffer

2000 µl

室温（RT）

最终RNA洗脱缓冲液。

 

注：  

1. 标有 * 的组分需使用前离心（短暂离心使液体沉至管底）。  

2. m6A-Positive Control 为合成寡核苷酸，用于实验质控。  

2. 储存与运输条件

运输方式  

  - 部分组分常温运输（如ICB、PDB、RPS等）。  

  - 部分组分冰袋4℃运输（如抗体、酶、磁珠等）。  

储存稳定性

  - 正确储存条件下，试剂盒有效期为6个月（从发货日期起）。  

  - 避免反复冻融：-20°C保存的组分（如CEM、m6A抗体）建议分装使用。  

需自备的实验材料

类别

具体物品

仪器设备

涡旋混合器、磁力架（适配96孔PCR板）、PCR仪（55℃孵育）、旋转摇床/振荡器。

耗材

0.2 ml/0.5 ml PCR管、带滤芯吸头、1.5 ml离心管。

试剂

100%乙醇、无RNase水、1× TE缓冲液（用于RNA稀释）。

关键组分功能说明

- CEM (Cleavage Enzyme Mix)：  

  - 同时片段化RNA并切割非m6A修饰区域，提高富集特异性。  

  - 注意：反应时间严格控制在4分钟，避免过度切割。  

- Affinity Beads：  

  - 结合m6A抗体，用于靶标RNA的免疫沉淀。  

  - 操作提示：洗涤时需彻底重悬磁珠，避免损失。  

- Proteinase K：  

  - 消化抗体-磁珠复合物，释放富集的RNA。  

组分使用注意事项

- 抗体与磁珠：  

  - m6A抗体和Affinity Beads需避免长时间室温暴露，使用后立即放回4°C或-20°C。  

- 酶活性保护：  

  - CEM和Proteinase K需-20°C保存，使用前短暂离心，避免反复冻融。  

- 阳性对照：  

  - 每次实验建议同时运行阳性对照（m6A-Positive Control）和阴性对照（Non-immune IgG），以验证实验有效性。  

实验步骤

免疫捕获与切割（Immunocapture and Cleavage）

1. 准备免疫捕获溶液（每管200 µl）：

   - 样品管：174–189 µl ICB + 2 µl m6A抗体 + 5–20 µl RNA样品 + 4 µl Affinity Beads。

   - 阴性对照（IgG）：174–189 µl ICB + 2 µl Non-immune IgG + 5–20 µl RNA样品 + 4 µl Affinity Beads。

   - 阳性对照：191 µl ICB + 2 µl m6A抗体 + 3 µl Positive Control Oligo + 4 µl Affinity Beads。

   - 注意：抗体终浓度需为2 µg/管；使用前充分混匀Affinity Beads。

2. 孵育：室温下旋转孵育90分钟。

3. RNA切割：

   - 每管加入10 µl NDE + 2 µl CEM，室温孵育4分钟。

   - 磁力架吸附2分钟，弃上清（避免吸到磁珠）。

4. 洗涤：

   - 用150 µl WB洗涤3次，再用150 µl PDB洗涤1次。

   - 每次洗涤后磁力架吸附1–2分钟，弃上清。

富集RNA的释放与纯化（Enriched RNA Release/Recovery）

1. 制备Protein Digestion Solution：按1:10混合Proteinase K与PDB（如1 µl Proteinase K + 9 µl PDB）。

2. 消化蛋白：

   - 每管加入20 µl Protein Digestion Solution，55℃孵育15分钟（无需加热盖）。

   - 磁力架吸附2分钟，转移上清至新PCR管。

3. RNA纯化：

   - 加入20 µl RPS + 160 µl 100%乙醇（阳性对照需25 µl RPS + 200 µl乙醇）。

   - 加入2 µl RNA Binding Beads，充分混匀10次，室温孵育5分钟。

   - 磁力架吸附2分钟，弃上清。

4. 洗涤：

   - 用150 µl 90%乙醇洗涤2次（每次磁力架吸附后弃上清）。

5. 洗脱RNA：

   - 加入13 µl Elution Buffer，室温孵育5分钟。

   - 磁力架吸附1分钟，转移13 µl上清至新管（立即使用或-20℃保存）。

注意事项

- 防污染：使用带滤芯的吸头，每次转移液体更换吸头；全程佩戴手套。

- 试剂储存：

  - CEM、m6A抗体、Positive Control需-20℃保存。

  - WB使用前检查盐沉淀，必要时37℃温育溶解。

关键步骤

  - 免疫捕获时确保抗体充分结合（90分钟旋转孵育）。

  - CEM反应时间严格控制在4分钟，避免RNA过度降解。

  - Proteinase K消化需55℃孵育15分钟以确保RNA释放。

质量控制

  - 阳性对照用于验证实验有效性。

  - 阴性对照（IgG）用于评估非特异性背景。

问题排查

  - 无富集信号：检查RNA质量、抗体活性、CEM储存条件。

  - 高背景：增加洗涤次数或延长洗涤时间（WB洗涤可增至4次）。

实验流程图

1. RNA → 免疫捕获m6A → 靶标切割（CEM）→ 洗涤 → 蛋白消化 → RNA纯化 → PCR/测序。