细胞溶酶体膜通透性/完整性荧光检测试剂盒

(LK-3611)

细胞溶酶体膜通透性（LMP）/完整性检测试剂盒是利用荧光染料吖啶橙的溶酶体吸收和细胞内再分布方法进行检测。细胞膜通透性荧光染料选择性地聚集在溶酶体内呈现荧光染色，经过处理的细胞的溶酶体通透性增加后，荧光染料由溶酶体释放到细胞浆中，可以通过荧光染料的不同荧光强度变化，来分析和观察溶酶体膜通透性变化的经典的技术方法。该方法适用于各种活体细胞溶酶体（动物、人体、昆虫等）膜通透性的检测。

溶酶体（lysosome）是一种动态性的、多态性的、含有水解酶的细胞器，具有接受和降解来自于分泌性、内吞性（endocytic）、自噬性（autophagic）、吞噬性（phagocytic）膜运转通路中的大分子。其功能是膜依赖性，具有解毒和防御作用。溶酶体在细胞凋亡调节中的研究越来越受到重视，溶酶体膜通透性（LMP）改变可以启动溶酶体凋亡途径，LMP改变可能被证明是一种有价值的治疗方法，可以作为细胞死亡的触发器，也可以作为治疗药物释放参与细胞凋亡的指标之一。

溶酶体膜是溶酶体内基质和胞浆之间的生理屏障，为整合性糖蛋白，防止细胞自我降解。一旦溶酶体膜去稳定（destabilization），例如碱性化或内容物移位（translocation），将导致质子和水解酶外漏，而造成细胞器功能异常，进而产生细胞坏死、凋亡，以及病理症状，例如朊病毒脑病（prion encephalopathies）、阿茨罕默病、心肌缺血、脊髓灰质炎病毒感染、补体激活型肺损伤（complement activation-produced lung injury）、急性组织损伤等疾病。其中膜通透性增加，是溶酶体膜去稳定性或去完整性的标志之一，溶酶体内容物大量释放到胞浆中，直接影响细胞的存活。

吖啶橙（acridine orange；AO）是一种亲溶酶体（lysomotropic）异染性（metachromatic）的荧光染料，在完整的溶酶体内，为质子化（protonated）寡聚体（oligomeric）形式，呈现红色荧光（激发波长555 nm，发射波长616 nm），而在胞浆内，为单体去质子化形式，呈现绿色荧光（激发波长490 nm，发射波长526 nm）。吖啶橙进入溶酶体后重新分布，即吸收和细胞内再分布（uptakeand redistribution），用于分析溶酶体膜通透性状况。

规格：

50T/¥1500，100T/¥2680

保存温度

2-8℃ 避光

注意事项

1.染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。

2.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

6个月

检测方法

荧光酶标仪/荧光光度计/流式细胞仪

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品应用

荧光酶标仪/荧光光度计/流式细胞仪

仪器准备

1.荧光酶标仪或光度计或流式细胞仪

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS 缓冲液或HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.荧光专用黑色96孔板

使用注意事项

1. 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。

2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使溶液集中于管底。

3. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

4. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。

5. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

6. 染色后立即进行分析。

7. 本试剂盒主要用于细胞内溶酶体膜通透性变化的定性检测。

8. 必须使用荧光检测专用黑色96孔板。

使用方法

1. 染色工作液的配制：根据样品数，用染料稀释液将AO染料进行10倍稀释， 然后再用PBS或HBSS缓冲液将以上AO稀释液进行 20倍稀释，配制成BBcellProbe® AO染色工作液。

2. 制备好的的细胞模型移除培养基，用PBS洗一次。

3. 将 BBcellProbe® AO染色工作液加入已处理好的细胞，在37℃孵育15-60 分钟。

4. 用冷的洗涤液洗涤细胞2-3次。

5. 然后用该细胞进行荧光细胞溶酶体膜通透性变化情况检测。激发波长 555 nm，发射波长616 nm，检测红色荧光强度。

【注】：

l 荧光强度减弱，溶酶体膜通透性增加。l 最好使用荧光酶标仪、荧光光度计、流式等设备测定。没有条件也可以拍照分析，需要使用相应的荧光强度分析软件。