心脏细胞分离与培养试剂盒,LK-1272

产品概述  

本试剂盒提供心脏细胞（如心肌细胞、成纤维细胞）分离与培养所需的完整溶液体系，适用于小鼠心脏灌注消化法。所有组分经严格质量控制，确保细胞活性和实验重复性。  

产品组分与保存条件

实验前准备  

解冻：将-20℃保存的 包被液、消化液、B液、C液 提前置于37℃水浴解冻。  

包被培养板：  

   - 取包被液 按1:10稀释（如100 μL原液 + 900 μL PBS），加入6孔板（1 mL/孔）。  

   - 37℃孵育≥2小时（或4℃过夜），使用前吸弃包被液，勿干燥（吸出包被液后，PBS润湿）。  

配制工作液（现配现用）：  

   - 灌注液（17 mL）：20 mL基础液中加入 0.2 mL B液 + 0.8 mL C液。  

   - 灌注终止液（50 mL）：50 mL基础液中加入 0.5 mL B液 + 2 mL C液。  

   - 消化液（25 mL）：25 mL基础液中加入 0.25 mL B液 + 1 mL C液。  

   - 消化终止液（20 mL）：19 mL灌注终止液 + 1 mL FBS（终浓度5%）（FBS自备）。  

操作步骤  

心脏灌注与消化  

1. 预灌注：  

   - 麻醉小鼠，开胸暴露心脏，剪断下腔静脉和降主动脉。  

   - 从右心室底部进针，快速灌注 7 mL灌注液（清除血液）。  

   - 夹闭主动脉，剪下心脏，置于 10 mL灌注液 中，从左心尖进针缓慢灌注 10 mL灌注液。  

2. 终止灌注：  

   - 左心尖同一进针点快速灌注 3 mL灌注终止液。  

3. 消化心脏：  

   - 将心脏转移至 消化液 中，左心尖进针快速灌注 20 mL消化液（可重复灌注至组织变软变白）。  

   - 将心脏置于 3 mL新消化液中，将心脏轻轻撕碎至1mm³大小，无菌滴灌吹打至无明显组织块。  

细胞分离与纯化  

1. 终止消化：  

   - 加入 5 mL消化终止液，吹打2分钟；重复一次（总计加入10 mL终止液）。  

2. 过滤与沉降：  

   - 用100 μm滤网过滤消化液（终体积约13 mL），收集至离心管。  

   - 分3次加入 A液（每次44.2 μL），每次加入后轻柔颠倒混匀，37℃静置10分钟（促进心肌细胞沉降）。  

收集细胞：  

   - 吸弃上清（含成纤维细胞），用 专用培养基（CM） 重悬沉淀。  

   - 将细胞悬液接种至包被好的培养板，37℃培养1小时后换液（去除未贴壁细胞），此时可以对细胞进行干预。

注意事项  

关键步骤：  

- 灌注速度影响细胞存活率：快速灌注（清除血液）→ 慢速灌注（保护细胞）→ 快速终止。  

- 消化时间需优化：过度消化导致细胞死亡，不足消化降低得率。  

储存与稳定性：  

- 避免反复冻融 B液、C液、消化液，分装后使用。  

- A液需避光保存，现用现取。  

细胞培养：  

- 心肌细胞贴壁较弱，换液时轻柔操作。  

- 成纤维细胞可通过上清离心后单独培养（如需）。  

常见问题解答  

1.细胞得率低？  

检查消化液活性（新解冻批次）、心脏灌注是否彻底。  

2.心肌细胞纯度不足？  

增加A液沉降次数（最多4次），或缩短换液时间（30分钟）。  

3.试剂出现沉淀？  

37℃水浴加热5分钟并混匀（除A液外）。  

有效期：6个月（详见包装标签）