m6A RNA甲基化定量检测试剂盒（比色法），LK-80807

m6A RNA Methylation Quantification Kit (Colorimetric)

1. 产品基本信息

RNA甲基化是RNA的可逆翻译后修饰，其表观遗传地影响许多生物过程。它发生在不同的RNA中，包括tRNA，rRNA，mRNA，tmRNA，snRNA，snoRNA，miRNA和病毒RNA。不同的RNA-甲基转移酶具备相应的催化策略，用于RNA甲基化。

6-甲基腺嘌呤（m6A）是在存在于真核生物的RNA分子中最常见的和丰富的甲基化修饰和占所有RNA甲基化的80％以上。它可以被称为“第五RNA碱基”并且在调节胚胎发育和细胞命运中具有广泛的作用。

2. 产品简介

2.1 N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物mRNA中最普遍、最丰富的内部转录后修饰。

2.2 本试剂盒提供了一种简单、灵敏、高效的比色法，用于定量检测总RNA中整体的m6A水平。

2.3 检测结果通过测量450 nm处的吸光度来读取，最终计算出的m6A水平相对于总RNA的输入量进行标准化。

2.4 应用：适用于检测从动物组织、植物组织、细胞等多种样本中提取的总RNA的全局m6A甲基化水平。

3. 检测原理

3.1 结合：将总RNA样本加入到已包被有m6A捕获抗体的微孔板中，m6A甲基化的RNA会被特异性结合并固定。

3.2 检测：加入m6A检测抗体，与已结合的m6A甲基化RNA形成“抗体-RNA-抗体”夹心结构。

3.3 信号放大与显色：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，随后加入TMB底物。HRP催化无色的TMB产生蓝色的产物。

3.4 终止与读数：加入终止液后，反应液变为黄色。在酶标仪上于450 nm波长下测量吸光度值，该值与样本中的m6A水平成正比。

4. 试剂盒组分

4.1 预包被m6A抗体板：96孔板（12条×8孔），储存于-20°C。

4.2 m6A检测抗体：储存于-20°C。

4.3 HRP标记的抗检测抗体：储存于-20°C。

4.4 10X 洗涤缓冲液：储存于4°C。

4.5 10X RNA结合溶液：储存于-20°C。

4.6 10X 检测抗体稀释液：储存于-20°C。

4.7 TMB底物溶液：储存于4°C（避光）。

4.8 终止液：储存于室温。

4.9 m6A阳性对照（可选）：储存于-20°C。

4.10 注意：使用前请务必核对所有组分，并严格按照储存条件保存。

5. 实验前准备

5.1 仪器设备：

    5.1.1 酶标仪（能读取450 nm吸光度）

    5.1.2 恒温水浴锅或PCR仪

    5.1.3 涡旋振荡器

    5.1.4 微量移液器及无菌吸头

    5.1.5 无菌离心管

5.2 用户自备试剂：

    5.2.1 无RNase水

    5.2.2 总RNA样本（推荐使用高纯度RNA，A260/A280比值在1.8-2.0之间）

5.3 试剂配制（使用前新鲜配制）：

    5.3.1 1X 洗涤缓冲液：用去离子水将10X洗涤缓冲液稀释10倍。

    5.3.2 1X RNA结合溶液：用无RNase水将10X RNA结合溶液稀释10倍。

    5.3.3 1X 检测抗体稀释液：用无RNase水将10X检测抗体稀释液稀释10倍。

    5.3.4 检测抗体工作液：用1X检测抗体稀释液将m6A检测抗体按说明书指定比例稀释。

    5.3.5 HRP抗体工作液：用1X检测抗体稀释液将HRP标记的抗检测抗体按说明书指定比例稀释。

6. 实验步骤

6.1 标准曲线制备（如果试剂盒提供阳性对照）：按照说明书用1X RNA结合溶液对m6A阳性对照进行系列稀释，以建立标准曲线。

6.2 RNA变性：

    6.2.1 取200-500 ng总RNA（体积不超过10 μL），加入等体积的1X RNA结合溶液。

    6.2.2 将混合物在70-80°C下孵育5-10分钟，然后立即置于冰上冷却至少2分钟。

6.3 加样与结合：

    6.3.1 将变性后的RNA样本（共20 μL）加入到预包被板的孔中。

    6.3.2 设置阴性对照（只加1X RNA结合溶液）和空白对照（用于调零）。

    6.3.3 用封板膜密封板子，在室温下孵育60-90分钟，摇床轻微振荡。

6.4 洗涤：

    6.4.1 弃去孔内液体。

    6.4.2 每孔加入200 μL 1X洗涤缓冲液，静置1分钟后弃去。

    6.4.3 重复此洗涤步骤3次。最后一次在干净的吸水纸上拍干。

6.5 加入检测抗体：

    6.5.1 每孔加入50 μL 已稀释好的检测抗体工作液。

    6.5.2 用封板膜密封，室温孵育60分钟。

6.6 洗涤：重复6.4的洗涤过程。

6.7 加入HRP抗体：

    6.7.1 每孔加入50 μL 已稀释好的HRP抗体工作液。

    6.7.2 用封板膜密封，室温避光孵育30分钟。

6.8 洗涤：重复6.4的洗涤过程，通常建议洗涤4-5次以彻底去除未结合的HRP抗体。

6.9 显色：

    6.9.1 每孔加入50 μL TMB底物溶液。

    6.9.2 室温避光孵育10-30分钟，或直到阳性对照孔出现明显的蓝色。

6.10 终止反应：

    6.10.1 每孔加入50 μL 终止液。溶液应由蓝色变为黄色。

    6.10.2 轻轻晃动板子以确保混合均匀。

6.11 读数：

    6.11.1 在加入终止液后30分钟内，用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度值（OD450）。

7. 结果计算

7.1 计算净OD值：

    7.1.1 样本净OD值 = 样本孔OD值 - 阴性对照孔平均OD值

7.2 计算m6A百分比：

    7.2.1 如果有标准曲线：

        a. 根据标准曲线，将样本的净OD值代入，计算出样本中m6A的相对含量（ng）。

        b. m6A百分比 = (样本中m6A含量 / 加入的RNA总量) × 100%

    7.2.2 如果没有标准曲线（相对定量）：

        a. 此方法适用于比较不同样本间m6A水平的相对变化。

        b. 将对照组的平均净OD值设为1（或100%），实验组的m6A水平表示为相对于对照组的倍数变化。

        c. 相对m6A水平 = (实验组净OD值 / 对照组净OD值)

8. 注意事项

8.1 RNase污染：整个操作过程中务必使用无RNase的枪头、离心管和水，防止RNA降解。

8.2 RNA质量：RNA的纯度和完整性是实验成功的关键。

8.3 变性步骤：RNA热变性后必须立即置于冰上，这是暴露m6A位点、提高检测灵敏度的关键，切勿省略。

8.4 洗涤步骤：充分的洗涤是降低背景、提高信噪比的重要环节。确保每次洗涤都彻底。

8.5 显色时间：TMB显色时间需一致。如果颜色过深或上升过快，可适当缩短显色时间。

8.6 线性范围：确保样本的OD值落在标准曲线的线性范围内。如果样本OD值过高，可用1X RNA结合溶液稀释RNA样本后重新检测。

8.7 重复设置：建议每个样本和对照都设置2-3个复孔，以确保结果的准确性和可重复性。

请注意：本说明书为通用指南，不同品牌或批次的试剂盒在具体组分、浓度和孵育时间上可能存在差异。在进行实验时，请务必以您所购买试剂盒附带的官方说明书为准。