RNA提取试剂（Trizol配方），LK-3990

产品介绍  

本产品是一种用于从多种生物样本（如动物组织、植物材料、细胞、细菌等）中快速提取总RNA的即用型试剂。其核心成分为异硫氰酸胍和苯酚，基于经典的Trizol法（单相溶液法）原理，能有效地裂解细胞，抑制RNase活性，并保持RNA的完整性。提取的RNA纯度高，适用于后续的RT-PCR、Northern Blot、转录组测序（RNA-seq）、cDNA合成等分子生物学实验。

产品特点  

1.  高效裂解与抑制：强力裂解细胞和组织，同时迅速抑制内源性和外源性RNase，最大限度地防止RNA降解。

2.  高纯度与完整性：可有效分离RNA、DNA和蛋白质，获得纯度高的总RNA，A260/A280比值通常在1.8-2.0之间，且28S/18S rRNA条带清晰。

3.  广谱适用性：适用于多种样本类型，包括动物组织、培养细胞、血液、植物组织（需特殊处理）、细菌、酵母等。

4.  操作简便快速：整个提取流程可在1-2小时内完成，无需复杂的预处理步骤。

使用方法（仅供参考）  

实验前准备：

   RNase-free环境：确保实验台、移液器、离心管、吸头等均经过RNase去除处理。

   个人防护：佩戴手套、口罩和实验服，避免RNase污染和试剂接触皮肤。

   预冷离心机：确保离心机可在4°C下运行。

   试剂配制：

       氯仿（自备）

       异丙醇（自备，RNase-free）

       75%乙醇（自备，用RNase-free水与无水乙醇配制）

       RNase-free水（自备）

操作步骤：

1.  样本匀浆/裂解：

       组织：取50-100mg组织，在液氮中迅速研磨成粉末，加入1 mL Trizol试剂，充分 vortex 混匀。

       贴壁细胞：直接向培养皿中加入适量Trizol（每10 cm² 面积加1 mL），用移液器吹打至细胞完全裂解，转移至离心管。

       悬浮细胞：离心收集细胞，弃上清，加入1 mL Trizol，反复吹打至裂解。

2.  相分离：

       将匀浆液在室温（15-30°C）下静置5分钟，使核蛋白复合体完全解离。

       加入0.2 mL氯仿（Trizol体积的1/5），盖紧管盖，剧烈振荡15秒，室温静置2-3分钟。

       4°C，12,000 × g 离心15分钟。离心后溶液分为三层：下层红色的苯酚-氯仿相（含DNA和蛋白质）、中间层、上层无色水相（含RNA）。

3.  RNA沉淀：

       小心地将上层水相转移到一个新的RNase-free离心管中（切勿吸到中间层）。

       向水相中加入等体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置10分钟。

       4°C，12,000 × g 离心10分钟。离心后管底侧壁可见白色或半透明的RNA沉淀。

4.  RNA洗涤：

       小心弃去上清，注意不要丢失RNA沉淀。

       加入1 mL 预冷的75%乙醇，涡旋振荡或轻轻弹动管底，洗涤沉淀。

       4°C，7,500 × g 离心5分钟，小心弃去乙醇。

5.  RNA溶解：

       打开管盖，在超净工作台中空气干燥沉淀5-10分钟（切勿过度干燥，否则难以溶解）。当沉淀边缘变为半透明时即可。

       根据沉淀量加入20-50 μL RNase-free水，用移液器轻轻吹打数次，55-60°C水浴加热5-10分钟有助于完全溶解。

       取少量进行浓度和纯度检测，其余于-80°C保存。  

注意事项  

1.  RNase污染是首要敌人！全程务必使用RNase-free的耗材和试剂，勤换手套。

2.  安全第一：本试剂含有苯酚和异硫氰酸胍，具有毒性和刺激性。操作时请在通风橱内进行，并穿戴好防护用具。若皮肤接触，立即用大量清水冲洗。

3.  样本量：样本量与Trizol用量需匹配。组织或细胞量过多会导致DNA污染和RNA得率下降。

4.  分层与转移：相分离后，转移上清液是关键步骤。宁可少取，切勿吸入中间层或下层有机相，否则会严重污染RNA。

5.  干燥程度：RNA沉淀不要完全干燥，微潮的状态最容易溶解。过度干燥会极大地降低RNA的溶解度。

6.  溶解：溶解RNA时使用RNase-free水或TE缓冲液（pH 8.0），避免使用DEPC水直接溶解，因其可能影响后续酶反应。  

常见问题解答  

Q1： RNA的A260/A280比值偏低（<1.7）或偏高（>2.0）是怎么回事？

   <1.7（如1.5-1.7）：通常表示有蛋白质或苯酚残留。确保在相分离时没有吸入有机相，并彻底进行乙醇洗涤。

   >2.0：可能由于RNA降解严重，或测定时使用了非中性pH的水作为空白对照。请使用RNase-free水（pH ~7.0）进行稀释和调零。

Q2： RNA得率很低，可能是什么原因？

   样本起始量不足或过多。

   匀浆或裂解不彻底。

   在相分离时，吸上清液不彻底或误吸了沉淀。

   RNA沉淀在洗涤或弃上清时丢失。

   异丙醇沉淀效率低，可尝试延长静置时间或置于-20°C沉淀。

Q3： RNA发生降解，电泳条带弥散，怎么办？

   样本采集后未及时处理或冻存。

   实验操作过程中引入了RNase污染（检查手套、耗材、实验台）。

   匀浆或裂解时间过长，未能及时抑制RNase。

   溶解RNA时反复冻融，应分装保存。

Q4： 电泳时发现基因组DNA污染，如何避免？

   在匀浆裂解后，确保样品在室温下静置足够时间（5-10分钟）。

   相分离离心后，上清液转移时务必小心，绝不触碰中间层。

   若污染严重，可在Trizol裂解后、氯仿加入前，对裂解液进行高速离心（12,000 × g, 10 min, 4°C），取上清进行后续步骤。或者，提取后的RNA可用DNase I进行消化处理。

Q5： 提取植物RNA时有什么特殊注意事项？

   植物组织富含多糖、多酚和次生代谢物，会干扰提取。建议：

       在液氮中快速研磨，并立即加入Trizol。

       可适当增加Trizol用量。

       在相分离后，可将上清液转移至新的离心管，并再次用等体积氯仿抽提一次，以去除更多杂质。

       使用专门针对植物的RNA提取试剂盒可能效果更佳。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。