人补体蛋白C3 检测试剂盒 Human C3a(Complement Component 3a) Assay  Kit,E100718 

产品简介

本试剂盒采用双抗体夹心 ELISA 人补体蛋白C3 体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的人 FGL1 人补体蛋白C3 和辣根过氧化物酶标记的亲和素，抗人 FGL1 抗体与结合在包被抗体上的人补体蛋白C3  结合，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB 在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在 450 nm 波长处测 OD 值，FGL1 浓度与 OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中 FGL1 的浓度。

产品保存

  未拆封的试剂盒可在 2-8℃保存 6 个月

样本处理

1. 血清：全血样品于室温放置1小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于2-8℃，1000×g离心15分钟，取上清即可检测。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1 g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

4. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200 μL PBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。

5. 细胞培养上清或其他生物体液：收集液体后于2-8℃，1000×g离心20分钟，

除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

需要而未提供的试剂和器材

1. 酶标仪(450 nm波长滤光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3. 37℃恒温箱

4. 双蒸水或去离子水

5. 吸水纸

6. 加样槽

试剂盒组分

备注：

浓缩HRP酶结合物(100×)和底物溶液(TMB)请避光保存。

所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。

试剂体积以实际发货版说明书为准。相关试剂在分装时会比标签上

标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。

注意事项

1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9. 不能使用过期产品。

10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备

1. 提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂，剩余板条和试剂需 按照指定条件保存。

2. 洗涤液：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。提示从冰箱中取出的浓缩洗 涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。当日使用。

3. 标准品工作液：将标准品于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，避免起泡，配成10 ng/mL的标准品工作液(或加入1 mL 标准品&样品稀释液后，静置1-2分钟，用低速涡旋仪充分混匀。可通过低 速离心去除涡旋过程中产生的气泡)。然后根据需要进行倍比稀释。建议配 制成以下浓度：10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、0.16、0 ng/mL。

倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从10 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL到第一支EP管中混匀配成5 ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下页图示。提示：最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体。复溶后的10 ng/mL标准品工作液分装后放置-20℃保存，请在半个月内使用完，避免反复冻融。

倍比稀释的标准品工作液需要现配现用。

4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量(以100 μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩生物素化抗体于800×g离心1分钟，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度(例如：10 μL浓缩液+990 μL稀释液)。现配现用。

5. HRP酶结合物工作液：HRP酶结合物为HRP酶结合亲和素。实验前计算当次实验所需用量(以100 μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，将浓缩HRP酶结合物于800×g离心1分钟，以酶结合物稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度(例如：10 μL浓缩液+990 μL稀释液)。现配现用。

操作步骤

1. 分别设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔加入 100 μL 倍比稀释的标准品，空白孔加入 100 μL 标准品&样本稀释液，其余孔加入 100 μL 待测样本(建议所有的待检样本和标准品在检测中设立复孔；建议通过预实验或咨询技

术支持确定待检样本的稀释倍数)。给酶标板覆膜，37℃孵育 90 分钟。提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间宜控制在 10 分钟内。

2. 甩尽孔内液体，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液 100 μL，酶标板加上覆膜，37℃温育 1 小时。

3. 甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干。每孔加洗涤液 350 μL，浸泡 1 分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤 3 次。

提示：此 处与其他洗板步骤都可使用洗板机(参考北京拓普 DEM-3 型洗板机参数设置：2 点吸，每孔加入洗涤液 350 μL，振板 5 秒，吸液 0.5 秒)。洗板完成后请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。

4. 每孔加 HRP 酶结合物工作液 100 μL，酶标板加上覆膜，37℃温育 30 分钟。

5. 甩尽孔内液体，洗板 5 次，方法同步骤 3。

6. 每孔加底物溶液(TMB)90 μL，酶标板加上覆膜，37℃避光孵育 15 分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时(前 4 个显色孔出现明显蓝色梯度)，即可终止。提前 15分钟打开酶标仪预热。

7. 每孔加终止液 50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8. 立即用酶标仪在 450 nm 波长测量各孔的光密度(OD 值)。

实验结果计算

1. 计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线。

2. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

试剂盒性能

1.检测范围：以产品附带说明书为准。

2.灵敏度：以产品附带说明书为准。

3.特异性：可检测样本中的人 FGL1，且与其它类似物无明显交叉反应

4.重复性：板内，板间变异系数均<10%

特别说明

由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

1. 最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

2. 不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书仅作参考。

3. 只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。

4. 本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

5. 使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。

6. 若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

7. 某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。