PNGase F，LK-8705

产品介绍

PNGase F 是一种酰胺水解酶，能够催化切割天冬酰胺（Asn）连接的寡糖与多肽或蛋白质主链之间的β-天冬氨酰葡萄糖胺键。它能高效、彻底地切除绝大多数真核生物蛋白质上的N-连接聚糖，无论其结构复杂性如何（高甘露糖型、杂合型或复杂型）。

该酶是糖生物学研究、蛋白质组学、生物制药质量控制和糖蛋白表征中的核心工具酶。通过去除糖链，可以研究糖基化对蛋白质结构、功能、稳定性、免疫原性和药代动力学的影响。

产品特点

1.  高切割效率： 能在较短时间内（通常1-3小时）完全去除N-连接糖链。

2.  广泛的底物特异性： 可切割所有类型的N-连接聚糖（高甘露糖型、杂合型、复杂型），适用性极广。

3.  高纯度： 经过严格纯化，不含其他蛋白酶和糖苷酶污染，确保反应的特异性和蛋白质底物的完整性。

4.  活性稳定： 在推荐的缓冲液体系中活性稳定，批间差小，实验结果重复性好。

5.  灵活的反应条件： 提供变性或非变性反应方案，以适应不同性质的蛋白质样品。

使用方法（仅供参考）

注意： 以下为通用操作流程，具体实验条件可能需要根据您的样品进行优化。强烈建议在进行关键实验前进行预实验。

A. 变性条件下的酶切反应（推荐用于难溶性或结构紧密的糖蛋白）

1.  样品变性：

       取适量糖蛋白样品（建议1-50 µg）于离心管中。

       加入1xGlycoprotein Denaturing Buffer（通常含0.5% SDS，40 mM DTT），混匀。

       在100°C 加热3-10分钟，使蛋白质完全变性。

       短暂离心，收集管壁液体。

2.  配制反应体系：

       将变性后的样品冷却至室温。

       依次加入以下组分（以50 µL总体系为例）：

注意： 加入去垢剂（如NP-40）至关重要，用于中和SDS对PNGase F的抑制作用。确保NP-40的浓度至少是SDS浓度的2倍（例如，0.5% SDS需加1% NP-40）。

3.  酶切反应：

       轻轻吹打混匀，短暂离心。

       在37°C 水浴或孵育器中反应1-3小时。对于糖基化程度高或难切的样品，可延长至过夜（16-18小时）。

4.  终止反应与分析：

       反应完成后，可将样品置于-20°C 保存，或直接进行后续分析。

       通过SDS-PAGE（观察分子量迁移）、Western Blot（使用凝集素或特异性抗体）、质谱（MS）或HPLC等方法验证去糖基化效果。

B. 非变性条件下的酶切反应（适用于可溶性好、结构松散的糖蛋白）

1.  配制反应体系：

       在离心管中直接配制以下体系：

2.  酶切反应与终止：

       混匀后，在37°C 反应1-3小时或过夜。

       反应完成后，进行后续分析。

注意事项

1.  储存与使用： 本品应在-20°C 冷冻保存。使用时请置于冰上，用后立即放回-20°C，避免反复冻融。

2.  去垢剂控制： 在变性反应方案中，必须加入足量的非离子去垢剂（如NP-40）来中和SDS，否则酶活性将被完全抑制。

3.  样品兼容性： 避免在反应体系中引入高浓度的盐酸胨、尿素、硫酸铵、甘油或强螯合剂（如EDTA），这些物质可能抑制酶活。确保反应缓冲液中含有适量的EDTA（如1-10 mM）以稳定酶活性。

4.  对照设置： 每次实验都应设置阴性对照（不加PNGase F，但经过相同的处理流程），以确认分子量的变化确实由酶切引起。

5.  酶活性单位： 1单位（U）PNGase F 定义为在37°C、pH 7.5条件下，1分钟内从1 nmol的RNase B中释放1 nmol寡糖所需的酶量。

6.  个人防护： 实验时请穿着实验服、戴手套，遵守实验室安全规程。

常见问题解答

Q1：PNGase F 酶切后，为什么在SDS-PAGE上看不到分子量变化？

   A： 可能原因有：

       蛋白质本身糖基化程度很低或没有N-连接糖链。

       酶活性不足或失活（检查储存条件和操作过程）。

       反应条件不当（如SDS未被充分中和，pH值不适宜）。

       糖链太小，导致的分子量变化在凝胶上无法分辨。建议使用Western Blot（凝集素染色）或质谱进行更灵敏的检测。

Q2：PNGase F 可以切割O-连接糖链吗？

   A： 不可以。PNGase F 特异性作用于N-连接糖链。去除O-连接糖链需要使用不同的酶，如O-糖苷酶（O-Glycosidase），通常需要与神经氨酸酶（Sialidase）和β1-4半乳糖苷酶（β1-4 Galactosidase）联用。

Q3：我的蛋白质含有二硫键，在变性条件下会被还原吗？

   A： 是的，标准的变性缓冲液中含有还原剂（如DTT或β-巯基乙醇），会破坏二硫键。如果您需要保持二硫键的完整性，请寻找不含还原剂的特殊变性方案或尝试在非变性条件下进行酶切。

Q4：反应缓冲液的最佳pH是多少？

   A： PNGase F 的最适pH范围为7.5 - 8.5。本产品提供的10× Reaction Buffer通常将pH优化在此范围内。

Q5：如何确定酶切是否完全？

   A： 最可靠的方法是质谱分析。通过比较酶切前后的分子量，可以精确判断糖链是否被完全去除。SDS-PAGE上的条带变为单一、清晰的低分子量条带也是一个很好的指示。

Q6：PNGase F 能否切除所有N-糖链？是否存在例外？

   A： 绝大多数N-糖链都可被PNGase F切割。一个罕见的例外是某些植物糖蛋白上存在的含有α1,3-核心岩藻糖的N-糖链，对PNGase F有抗性。在这种情况下，可能需要使用PNGase A。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。